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提示

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水相比例在HILIC模式下對分離有何影響?

2022-08-24

HILIC模式中洗脫調(diào)整方向

洗脫原理主要是極性相似相容和親水分離分配模式,洗脫時極性強的溶劑越多,保留時間越短;出峰順序是極性弱的先出,極性強的后出,與反相相反,因此適合保留極性強,在反相上無法保留的物質(zhì)。

實例

CTP、ATP、GTP、UTP的分離:

ATP:三磷酸腺苷

GTP:三磷酸鳥苷

CTP:胞嘧啶核苷三磷酸

UTP:三磷酸尿苷 

Ultimate? AQ-C18 4.6*250mm 5μm  磷酸鹽緩沖液(pH呈中性)-乙腈體系,梯度運行見下表:

微信截圖_20220824162528.png

效果圖

微信截圖_20220824162610.png

分析:各峰分離良好,但出峰均在純鹽相段出峰,保留弱,部分目標峰的峰型不好,方法重現(xiàn)性不好,易與溶劑峰重合。

根據(jù)HILIC的作用原理,該模式適合這類極性物質(zhì)的分離,故Topsil? Silica 4.6*250mm 5μm:

磷酸鹽-乙腈(25/75)

微信截圖_20220824162617.png

分析:  四種物質(zhì)分離完全,保留適中,但有雜質(zhì)峰干擾風險,峰形有可以優(yōu)化的空間,減少水相,延長保留。

磷酸鹽-乙腈(20/80)

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分析:分離良好,峰形改善,雜質(zhì)無干擾,各目標峰保留增強很多,一針運行時間較長,流動相中水相比例對保留與分離影響較大,與HILIC的分離原理符合,水相為強洗脫能力項,微小比例的改變對色譜效果影響大,水相比例減小。

磷酸鹽-乙腈(22/78)

微信截圖_20220824162628.png

分析:與預期相一致,保留時間縮短,與雜質(zhì)能較好分離,可以嘗試梯度,在HILIC模式中水相的微小變化對色譜圖影響大,因此兩針之間的平衡時間建議在10倍柱體積以上,而且平衡時間一致,也可以讓系統(tǒng)達到一個動態(tài)平衡,以保證分離效果的重現(xiàn)。

結(jié)論

運行HILIC模式時:

1. 考慮樣品極性和溶解性:首先目標一般是強極性物質(zhì),且更好是在高比例有機相中有一定溶解性,如果樣品在有機相中不溶或溶解度很低,或容易產(chǎn)生其他反應的,則不適用;

2. 考慮緩沖鹽與有機相的互溶性:調(diào)節(jié)流動相比例時,如果流動相中含鹽,要考慮鹽在有機相中的溶解度,避免出現(xiàn)鹽析等現(xiàn)象;

3. 關(guān)注系統(tǒng)真正的平衡狀態(tài):系統(tǒng)平衡不僅僅是關(guān)注基線噪音和漂移的問題,是連續(xù)進樣獲得穩(wěn)定的保留時間和峰面積,測試過程中會碰到系統(tǒng)平衡慢的問題,需要附上解決或改善方法;

4. 關(guān)注樣品的穩(wěn)定性:確保所使用的樣品溶液是更接近初始狀態(tài)的,測試過程中需關(guān)注溶液穩(wěn)定狀態(tài),必要時臨用新制;根據(jù)整個方法時樣品的主峰情況確定更終的配制方法和保存方法。

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